杨峰，葛保胜，刘双，于道永

（中国石油大学（华东）生物工程与技术中心，青岛266555）

摘要：采用蔗糖密度梯度离心法对钝硕螺旋藻光合膜蛋白(PSI)进行分离纯化，并对其光谱学性质、热稳定性及光合放氧活性进行分析表征。结果发现，采用蔗糖密度精度离心法，可以成功分离出4条色素蛋白质复合体条带，其中最下层务带为完整的PsI三聚体，其每毫克叶绿素a光合放氧活性达到420ymol/h。当温度达到50℃左右时，分离得到的PSI在溶液开始变性失活。

关键词：光系统I；钝顶螺旋藻；稳定性

中图分类号：Q176文献标志码：A文章编号：1672-3678(2010)01-0061-05

光合作用是地球上最伟大的化学反应之一，是人类利用太阳能的最有效的方式之一[1]。基于光合作用高效捕光和光能转换原理，Rupa等[2-3]将菠菜和蓝藻6803的光系统l(PSI)分别同定于固体纳米纤维Zn0和金电极上，获得了具有应用开发前景的光电流。Terasaki等[4]将嗜热Thermosynechococcusvulca-nus的光系统ll(PSll)固定于电极上，发现随着PSII固定量的增加，光电流也随之增加，证明了利用光系统复合体制成新型生物太阳能电池的可能性。然而

基于光合蛋白复合体的新型光电器件距实际应用还有很长的一段路要走。其中，如何大量制备高活性PSI并长时间保持其稳定性，对PSI基光电器件的光电效率和寿命具有重要影响，是PSI基太阳能电池开发的重要前提和保障。

第1个具有活性的PSI复合物是由Mullet等[5]采用蔗糖密度梯度离心从豌豆中分离出来的。这种方法后来被视为分离和纯化PSI的经典方法。许多学者采用相似方法从陆生植物和海洋藻类中成功分离到PSl[6-11]。对于太阳能电池而言，水生植物宽波长的吸光范围和低光弱光下较强的光吸收能力显然具有重要的意义[12-13]。

本文以来源广泛且生长速度较快的钝顶螺旋藻为材料，来分离完整的PSI复合体，并对其光谱学性质、多肽组成等生化特性进行表征，还对其稳定性进行初步研究。

1材料与方法

1.1钝顶螺旋藻的培养

钝顶螺旋藻（Spirulinaplaiensis）由中科院海洋所功能基因高效表达实验窜提供，用Zarrouk培养基，光照培养10d，离心收集藻体，-20℃存放待用。

1.2光系统I的提纯

类囊体膜的制备参考Bruce的方法[6]，整个实验除了特殊说明都在冰上进行。蔗糖梯度采用0.1～1mol/L连续梯度和2mol/L蔗糖梯度(HitachiCP80WX，P40ST水平转头)，将增溶后的类囊体膜铺在蔗糖密度梯度的最上层。4℃下、35638r/min，离心16h。

1.3分离条件的优化

将增溶实验的条件设为m(TritonX-100):m(叶绿素(Chl)=17.5:1、20:1、22.5;1、25:1、

27.5：1和30:1。测定不同增溶比时，超速离心得到各条带的叶绿素a(Chla)的含量[14]。

1.4光谱分析

用岛津uv-2450型紫外可见光谱仪测定上述离心得到的各条带的室温吸收光谱，试样池的光程为1cm．扫描速度300nm/min。采用日立F-2500型荧光光谱仪测定各条带的77K荧光发射光谱，扫描速度为200nm/min，激发波长为436nm，采用6mm低温荧光管。

1.5电泳分析

选用NuPACE4%-12%（质量分数）Bis-Tris梯度胶SDS-PAGE电泳对待测试样进行分析，经考马斯亮蓝R250染色，考察其多肽组成。

1.6圆二色谱(CD)及其热稳定性分析

圆二色光谱的测定在Bio-LogicMOS-450上进行，试样池光程为1cm，扫描范围620-750nm。采用自动加热系统，分别在25、30、35、40、45、50、55、60、65和70℃时测定试样的CD谱，观察试样随温度的变化情况。

1.7PSI放氧活性的检测

将纯化的PSI溶于缓冲溶液中(2.5mol/LVc、0.05mol/L2.6-dichloroindophenolsodium(DCIP).2H20、0.5mol/LNaN3和0.1mol/L甲基紫精(MV))，p(Chla)=10rLg/mL，测定在光照下溶液中的p(02)。采用HansatechChlorolab2型液相氧电极检测，光强度为750ol/(m2.s)，检测温度为25℃。

本文节选自《钝顶螺旋藻（spirulinaplatensis）光系统I的分离表征及稳定性》一文，详细信息见原文，文章刊于《生物加工过程》，2010年第1期。